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    當(dāng)前位置:生物測(cè)試 ?  蛋白實(shí)驗(yàn) ? 

    蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(WB)

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    蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(WB)

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    項(xiàng)目介紹

    WB(Western Blot,蛋白質(zhì)印跡法)實(shí)驗(yàn)是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的特性來(lái)檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。基本原理是經(jīng)過(guò)PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。


    樣品要求

    1、新鮮樣品:1、100mg(至少)新鮮組織,干冰運(yùn)輸;

    2、細(xì)胞:細(xì)胞類(lèi)型樣本細(xì)胞數(shù)為1-2*107以上,收集細(xì)胞后PBS清洗三遍,離心去除上清,干冰運(yùn)輸;

    3、血液樣品: 樣品無(wú)潛在性攜帶病原體和病毒。如果存在病毒的可能性,請(qǐng)滅活處理;

    (1)全血:采集新鮮血液,建議全血樣品用全血樣品RNA提取試劑盒抽提RNA,或者新鮮血液分離白細(xì)胞;處理后的樣本放入干冰或者﹣80℃冰箱保存,干冰運(yùn)輸寄送。

    (2)血漿:用EDTA等抗凝劑處理后的樣本,4℃ 4000rpm離心5分鐘,上層為血漿樣本,按每200μl血漿樣本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,渦旋搖勻,放入干冰或者-80℃冰箱保存,干冰運(yùn)輸寄送。

    (3)血清:用非抗凝管收集血樣,靜置分離上層血清,按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,渦旋搖勻,放入干冰或者-80℃冰箱保存,干冰運(yùn)輸寄送。

    4、蛋白樣品:未變性的蛋白需要存入-80°C ,干冰運(yùn)輸寄送;Loading Buffer煮沸的蛋白,需要提供蛋白濃度(濃度需在5μg/μl 以上,200μl樣品),冰袋運(yùn)輸寄送。

    5、植物組織樣品:選取新鮮組織,200mg以上組織,盡量避免衰老,病變,發(fā)霉的組織;將樣品剪成小塊放入液氮預(yù)冷的螺口離心管中,在液氮中速凍5min-80度保存,干冰運(yùn)輸寄送。

    6、菌體:收集菌體到1.5ml的離心管內(nèi),離心去上清,用1*pbs洗滌三次,液氮速凍5min后,-80度保存。

    項(xiàng)目案例

    常見(jiàn)問(wèn)題
    1、1、為什么蛋白質(zhì)印跡條帶大小與預(yù)期的不同?

    答:蛋白質(zhì)印跡是一種基于蛋白質(zhì)大小來(lái)分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。一般來(lái)講,蛋白質(zhì)越小,在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響,因此,觀察到的實(shí)際條帶大小可能與預(yù)測(cè)的不同。

    常見(jiàn)的因素包括:

    1.翻譯后修飾:例如磷酸化、糖基化等,可增加蛋白質(zhì)大小。

    2.翻譯后切割:例如許多蛋白先被合成為前蛋白,然后被切割產(chǎn)生活性形式,例如前半胱天冬酶。

    3.剪接變體和異形體:可變剪接和異形體可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。

    4.相對(duì)電荷-氨基酸(帶電和不帶電)多聚體組分,例如蛋白質(zhì)的二聚化。這種情況通常在還原條件下需要防止,但強(qiáng)相互作用會(huì)導(dǎo)致較大的條帶出現(xiàn)。

    2、2、蛋白樣本為什么要進(jìn)行還原和變性?

    答:為了使樣本被還原和變性,樣品緩沖液中會(huì)含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑,用來(lái)打破蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu),變成初級(jí)的氨基酸結(jié)構(gòu),同時(shí)以恒定的質(zhì)量比包被蛋白質(zhì),使其帶上負(fù)電荷。這一恒定的負(fù)電荷比是下一步凝膠電泳分離的關(guān)鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑,用來(lái)斷開(kāi)蛋白自身的二硫鍵,進(jìn)一步使蛋白質(zhì)變成線性結(jié)構(gòu),此圖中簡(jiǎn)單地展示了這一過(guò)程。順便提一下,有些抗體只能夠識(shí)別目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu),在這種情況下,樣本不需要被還原和變性。所以還原和變性的步驟可以省略。但是,大多數(shù)蛋白質(zhì)印跡分析都需要在還原和變性的體系中進(jìn)行。

    3、3、為什么檢測(cè)重組蛋白時(shí)難以獲得條帶?

    答:抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)時(shí),存在難以克服的困難,有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達(dá)的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時(shí),如果重組蛋白帶有標(biāo)簽,標(biāo)簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標(biāo)簽位于重組蛋白的C或N末端,以降低這種情況發(fā)生的可能性(而不是位于蛋白質(zhì)的閱讀框中間)。

    4、4、牛奶和 BSA 封閉有區(qū)別?

    答:抗體可能對(duì)封閉劑敏感,一般來(lái)講,BSA會(huì)產(chǎn)生更清晰的結(jié)果,因?yàn)锽SA含有較少的蛋白,因而抗體較少與其發(fā)生交叉反應(yīng)。但并非總是如此,有些抗體在牛奶中的效果更好,因?yàn)榕D毯懈喾N類(lèi)的封閉蛋白,能封閉更多不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)。

    蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(WB)

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